Cinétique de traduction des ribosomes à l'échelle de la molécule unique par microscopie de fluorescence
Résumé
Les ribosomes sont des moteurs moléculaires qui se déplacent le long des ARN messagers pour lire l'information génétique et synthétiser les protéines. La dynamique de ce processus de traduction est encore mal connue, notamment la façon dont le ribosome se déplace le long de l'ARN messager. Les ribosomes étant indispensables à toute forme de vie, une meilleure connaissance des mécanismes traductionnels pourrait aider à l'élaboration d'antibiotiques spécifiques d'organismes pathogènes. Pouvoir observer la position de ribosomes individuels pendant le processus de traduction est donc un enjeu important. Dans nos expériences, nous développons plusieurs méthodes de marquage fluorescent pour pouvoir observer de façon efficace des ribosomes individuels se déplaçant le long d'un ARNm. Dans les travaux présentés ici, nous posons des jalons fluorescents sur la séquence codante de l'ARNm, les départs des marqueurs signalant alors le passage des ribosomes à leurs emplacements. Notre montage expérimental est basé sur la microscopie de fluorescence en réflexion totale, et les complexes ARNm-ribosome sont donc fixés sur la lamelle de microscope afin d'être éclairés par l'onde évanescente. Nous avons marqué l'ARNm en l'hybridant à un oligonucléotide marqué avec un fluorophore organique de type ATTO qui sera détectable au sein de l'onde évanescente. La chimie de surface utilisée pour cette accroche doit être très bien contrôlée pour ne pas fixer les complexes de façon non-spécifique, ce qui risquerait de paralyser la traduction. Nous utilisons des surfaces couvertes de PEG sur lesquelles les ARNm sont fixés par l'intermédiaire de liaisons biotine-streptavidine. Les ribosomes sont initialement immobilisés sur l'ARNm puis suite à l'injection d'un système de traduction in-vitro, ils peuvent traduire la protéine et atteindre les oligonucléotides marqués. Les ribosomes sont capables de les décrocher pour pouvoir poursuivre la traduction. Ces dissociations se traduisent par une disparition du signal de fluorescence des marqueurs puisqu'ils diffusent hors de l'onde évanescente. Nous avons ainsi pu observer la distribution des durées de traduction jusqu'à un endroit donné de l'ARN messager pour une population de ribosomes individuels. Un contrôle a été effectué en bloquant les ribosomes à l'aide d'un antibiotique. Nous prévoyons de marquer l'ARNm avec deux fluorophores différents afin de détecter le passage du ribosome en deux endroits distincts. Nous devrions ainsi obtenir des statistiques plus précises sur la dynamique du ribosome.