Bases moléculaires et cellulaires de l'assemblage de l'axonème des cils mobiles - Thèses de Sorbonne Université Access content directly
Theses Year : 2023

Molecular and cellular bases of the axoneme assembly in motile cilia

Bases moléculaires et cellulaires de l'assemblage de l'axonème des cils mobiles

Lucie Thomas

Abstract

Dynein arms (DAs), the motors of ciliary and flagella beating, are anchored with a regular spacing along cilia and flagella axonemes. Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a rare respiratory disease due to defects in motile cilia. This mainly recessive condition combines laterality defects in half of the patients and frequent male and female hypofertility. About 25% of PCD patients show an absence of both outer and inner DAs. Those patients carry mutations in one of the 13 implicated genes that drive, for most of them, the cytoplasmic assembly of DAs. The aim of this thesis was to clarify the role of two co-chaperones, part of the cytoplasmic DA assembly complexes and encoded by PCD genes newly (TTC12) or recently (PIH1D3) identified. Our work on TTC12 revealed for the first time the existence of different mechanisms of DA assembly between respiratory cilia and sperm flagella in humans. This is in keeping with the peculiar phenotype of patients with TTC12 mutations: a predominant male infertility associated with mild respiratory signs. Our data also show the existence of a distinct DA assembly process for the different subspecies of inner DAs. Within the framework of this study, we developed an original cellular model of human airway epithelial cells (HAECs) differentiated in vitro at air-liquid interface, in which genes can be CRISPR-Cas9-invalidated. This tool opens new avenues for the study of the pathophysiology of airway diseases. Our study on PIH1D3, which mutations underlie the unique known X-linked non-syndromic PCD, showed that women who carry a heterozygous PIH1D3 mutation displayed variable airway phenotypes (from asymptomatic to severe respiratory symptoms) in close relation to the X-inactivation rate of the mutated allele. This has been shown by two approaches that assess DNA methylation of CG dimers: enzymatic digestion at the HUMARA locus and bisulfite conversion at the PIH1D3 locus. Those results prompt to search for heterozygous mutations in PIH1D3, in anticipation of a genetic counselling, in (i) females relatives of male PCD patients with a PIH1D3 defect, and (ii) females with mild chronic respiratory symptoms of unknown etiology. In both cases, diagnosis is difficult to estabilsh in those women given the absence of situs inversus, mild respiratory signs, and normal nasal NO. At the prospect of gene or RNA therapy, this work suggests that reaching 30% of PIH1D3 expression could significantly improve the airway phenotype in patients.
Les bras de dynéine (BDs), moteurs du mouvement ciliaire et flagellaire, sont ancrés à intervalles réguliers le long de l'axonème des cils mobiles et des flagelles. Les dyskinésies ciliaires primitives (DCP) sont des maladies respiratoires rares, de transmission essentiellement autosomique récessive, liées à un défaut des cils mobiles, souvent associées à une infertilité masculine. Environ 25% des patients DCP présentent une absence des BDs externes et internes. Ces patients portent des mutations dans un des 13 gènes impliqués qui codent, pour la plupart, des constituants des complexes cytoplasmiques d'assemblage des BDs. L'objectif de cette thèse était de préciser le rôle de deux co-chaperonnes appartenant au(x) complexe(s) d'assemblage cytoplasmique des BDs, codées par des gènes nouvellement (TTC12) ou récemment (PIH1D3) impliqués dans les DCP. Nos travaux sur TTC12 ont révélé pour la première fois l'existence de mécanismes d'assemblage des BDs différents entre les cils mobiles et les flagelles chez l'Homme, expliquant le phénotype particulier de ces patients : infertilité masculine prédominante et atteinte respiratoire modérée. Nos données démontrent également l'existence de mécanismes d'assemblage distincts entre les différents sous-types de BDs internes. Ces travaux nous ont conduits à développer un modèle de cellules épithéliales nasales humaines (CENH) différenciées in vitro en interface air-liquide avec invalidation de gène par CRISPR-Cas9. Cet outil ouvre de nouvelles perspectives pour l'étude de la physiopathologie de maladies respiratoires. Notre étude sur PIH1D3, responsable de la seule DCP non syndromique récessive liée à l'X, a montré que les femmes porteuses hétérozygotes d'un défaut de PIH1D3 présentaient des symptômes respiratoires variables (absents à sévères) en relation avec le taux d'inactivation du chromosome X qui porte l'allèle muté. Ce taux d'inactivation a été déterminé par l'évaluation de la méthylation des dimères CG selon deux approches : digestion enzymatique au locus HUMARA et conversion au bisulfite au locus PIH1D3. Ces résultats incitent donc à rechercher une mutation hétérozygote de PIH1D3, en vue d'un conseil génétique, chez (i) des femmes apparentées aux patients masculins avec DCP liée à PIH1D3, et (ii) des femmes avec infections respiratoires chroniques sans étiologie identifiée. Dans les deux cas, le diagnostic de DCP est difficile à porter chez ces femmes : absence de l'infertilité masculine, du situs inversus, signes respiratoires modérés, NO nasal normal. Ce travail indique que dans la perspective d'une thérapie génique ou ARN, une compensation d'environ 30% du niveau de l'expression de PIH1D3 pourrait améliorer significativement le phénotype respiratoire des patients.
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Cite

Lucie Thomas. Bases moléculaires et cellulaires de l'assemblage de l'axonème des cils mobiles. Génétique humaine. Sorbonne Université, 2023. Français. ⟨NNT : 2023SORUS097⟩. ⟨tel-04578971⟩
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